当一束激光照射在单个细胞上时，细胞内的化学物质会对光波产生吸收、反射或散射作用。每种波长的散射光都有其独特的特征，通过识别细胞结构内不同的分子类型（蛋白质、糖类或核酸）以及结构内存在的化学键对照射光散射的特异性光谱信号，可实现对不同分子的鉴定。几十年来，研究者们试图通过使用这种散射光谱信号（又称为拉曼光谱，Raman spectra）作为化学指纹来表征细胞。
不同于流式细胞术（Flowcytometry）、微流控技术（Microfluidics）等其他细胞分选方法，依赖于拉曼光谱学（Raman spectroscopy）的技术不需要对细胞进行标记，且在许多应用中较流式细胞术敏感性和特异性更高。基于此原理发展出的更好的研究方法，如表面增强拉曼光谱技术（Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS），通过将化学物质吸附在金属的表面，增强分子附近电场，促进散射光谱信号发放，可进一步提升对分子鉴定的敏感性和特异性。使用固定于金或银等金属制成的纳米颗粒上的抗体，可在一个分析测试中同时处理6-7个SERS，提供比荧光标记更高辨别率的分子鉴定方法。
随着检测设备和分析方法的快速发展，拉曼光谱学技术在生命科学领域越来越受到青睐，来自英国格拉斯哥市斯特拉斯克莱德大学（University of Strathclyde in Glasgow）的化学教授邓肯·格雷厄姆（DuncanGraham）讲道：“探测器的巨大改进和光源的发展，使得在保持系统性能的同时降低了成本，促进拉曼光谱学仪器在近五年取得了非常快速的发展。反应更快的相机使得对光谱的捕捉时间缩小到微秒级别，更强的软件和统计工具使得对细胞分选和分析后产生的大数据集的分析成为可能。”
以下列举四例利用拉曼光谱学对细胞进行的研究。
1、 改善干细胞疗法
利用人类多能干细胞（Human pluripotent stem cells, hPSCs）是基于干细胞对多种疾病治疗充满希望的途径。但是由hPSCs制备出的细胞经常包含残余未分化细胞，这些细胞的存在使得hPSCs在移植进动物体内后容易引起肿瘤发生。如果残余未分化细胞占总制备细胞的0.1%或更高，流式细胞术或其他检测方法才能够检测出这些细胞，但在使用小鼠进行的一项由未分化细胞引起肿瘤的研究中显示，即使是占比0.001%的未分化细胞也可能会导致畸胎瘤的产生（Cell Cycle, doi:10.4161/cc.8.16.9353, 2009）。hPSCs移植后能否引起肿瘤发生是评价该细胞纯度和安全性的金标准，但此过程通常需要三个月，费用昂贵且存在不确定性，因此给临床干细胞治疗带来很大困扰。
美国艾莫利大学（Emory University）的学者采用SERS技术对hPSCs中的残余未分化干细胞进行了探测和筛除。他们将纳米金颗粒表面包被两种干细胞表面蛋白标志物SSEA-5和TRA-1-60的抗体，再覆以聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）以降低非特异性。他们在混有已知比例成纤维细胞的hPSCs中测试了该纳米颗粒，以确定SERS信号的精确性。实验结果发现，该技术可在一百万个成纤维细胞的背景中识别出仅存的一个干细胞，比流式细胞术的敏感性高2000-15000倍。该技术在hPSC来源的心肌细胞的培养中也同样有效，高度的敏感性和特异性是该分析方法较其他方法的核心优势。针对不同细胞类型应优化条件找到每颗纳米颗粒最适密度的配基，本例中为每颗纳米颗粒25个SSEA-5抗体分子（Biomaterials, doi:10.1016/j.biomaterials.2016.07.033, 2016）。
图1. 表面连接干细胞标志物抗体的纳米金颗粒与细胞结合增强拉曼光谱信号（SERS）
2、 提高细胞分类特异性
多数利用拉曼光谱的研究依赖对细胞的单次拉曼光谱的阅读，但是由于真核细胞的直径通常大于所使用的激光束的直径，导致此方法缺乏准确性。使用单次拉曼光谱阅读时，细胞是否正处于DNA复制期、是否正发生凋亡和坏死以及细胞内的脂滴和蛋白质的数量都会影响测试结果，激光束照射在细胞核和胞质两个部位时也会导致较大差异。理想状态下应该对单细胞进行多次拉曼光谱阅读测试，但这通常会使时间和经济成本大大增加，研究的效率就会相应降低。
来自德国莱布尼茨光子技术研究所（Leibniz Institute of Photonic Technology, Germany）的研究人员发现，使激光束在单个细胞内沿任意线或其他定义好的形状扫描可产生连续的拉曼光谱信号。许多商业光谱仪通常被设计用来分析材料而不是细胞，针对此情况，该团队研究人员利用几种不同的光学镜头、一个多模光纤、机械表和其他组件设计出一种拉曼显微镜，该显微镜可进行单细胞的单点或多点拉曼光谱测试（Biomed Spectrosc Imaging, doi:10.3233/BSI-160141, 2016），且成本较传统商业拉曼光谱仪大大降低。
他们利用此拉曼显微镜对两种胰腺癌细胞系和一种T细胞系进行了分析，并将结果与传统单次拉曼光谱读取的实验方法结果进行了比较，发现利用此方法进行的分析组内差异更小，因此采用该方法通过分析较少的样本即可构建出可靠的细胞分类模型。通过此方法，采用只包含20个细胞分析数据的模型即可对细胞分类达到90%的准确率。该方法有望发展为利用拉曼光谱学对循环肿瘤细胞进行高效率、高通量检测的手段（Analyst, doi:10.1039/C6AN01018K, 2016）。
图2. 使用拉曼显微镜对细胞进行全细胞的分析显示大分子在胞内不均匀分布
3、 追踪癌细胞死亡
利用肿瘤细胞标志物使纳米颗粒靶向结合肿瘤细胞，再给予激光照射加热纳米颗粒可实现特异性地杀伤肿瘤细胞，但其分子机制尚不明确。先前的研究利用流式细胞术和共聚焦显微镜技术检测到了线粒体膜电位的变化，但这些结果都无法确定纳米颗粒是否进入到了癌细胞内，也无法区分癌细胞是通过凋亡还是坏死而被杀死。实验结果的差异被归因于所用纳米颗粒的大小和形状的差异或使用激光照射的强度和时间的差异。
来自美国佐治亚理工学院（Georgia Institute of Technology）的研究者利用具靶向活力的纳米金颗粒去触发热引起的细胞死亡，结合SERS技术实时监测细胞死亡过程。通常SERS技术使用的纳米颗粒大小在50 nm左右，但更小直径的颗粒在激光照射时可减少反射，吸收更多的能量，使产生的热量更易达到杀死细胞的标准。因此该团队研究人员使用了约29 nm直径的纳米金颗粒，以PEG包被并与可增进细胞核吸附的多肽相连接，使用0.2 nM浓度的该纳米颗粒处理细胞，使用785 nm波长激光束对样本照射2小时并收集SERS光谱信号。
最初的光谱信号变化反映出激光照射打破了细胞内蛋白质间的二硫键，随后的信号表明更多的蛋白质和脂质结构由于激光照射引起的热效应而受到破坏，最终导致了细胞的死亡。SERS信号表明利用此方法对细胞的杀伤与直接将细胞放入烤炉中被加热杀死的过程相似，与纳米颗粒的大小或激光强度无关，但高于阈值的纳米颗粒浓度和激光强度仍是引起细胞死亡的必要条件（J Am Chem Soc, doi:10.1021/jacs.5b10997, 2016）。
4、利用SERS诊断和量化疟疾的严重程度
现已有技术可实现当场、低成本、快速地诊断疟疾，但这些技术在早期感染时对疟原虫数量的鉴定缺乏敏感性和特异性。基于实验室技术的流式细胞术可对感染患者的红细胞进行分选，敏感性更高，但通常只能用来分析较少的样本量且主要用于实验室研究，来自新加坡南洋理工大学（Nanyang Technological University, Singapore）的研究者们通过使用SERS技术使廉价、高敏感性的疟疾感染量化诊断得以实现。
在疟疾感染过程中，疟原虫（Plasmodium falciparum）以红细胞中的血红蛋白（Hemoglobin）为生，并将其转化为疟原虫色素（Hemozoin），该物质可作为疾病诊断的标志物，且可被拉曼光谱仪检测到。研究者们采用了两种方法，首先他们合成了一种纳米银颗粒并与从裂解的红细胞中收集的疟原虫色素晶体混合，与纳米颗粒结合的疟原虫色素可产生特异的拉曼光谱信号并被检测到，且敏感性达到了0.01%，约为每微升血液500个疟原虫级别，较流式细胞术敏感性高200倍。在第二种方法中，他们在疟原虫体内原位合成纳米颗粒，通过超声处理裂解红细胞，避免使用脂类溶剂Triton-X，从而使疟原虫及包含疟原虫色素的小液泡得以完整保留，最后在这些小液泡中形成的纳米颗粒可吸附更多的疟原虫色素，与传统裂解红细胞释放疟原虫色素的方法相比，利用此方法可将检测灵敏度提高到约每微升血液2.5个疟原虫浓度。
第一种方法使SERS测试的组内差异较小，使SERS读数和疾病的严重程度有较强的相关性，第二种方法由于灵敏度极高，可作为早期诊断的工具。通过工程技术改造样本和纳米颗粒的制作过程，使其在一个微流体设备上完成，可实现更高效便携、低成本的疟疾现场诊断（Sci Rep, doi:10.1038/srep20177, 2016）。
图3. 左图红箭头示疟原虫小液泡原位合成的纳米银颗粒，右图示细胞裂解后加入纳米颗粒
来源：Jyoti Madhusoodanan, Using Raman Spectroscopy to Identify CellTypes, The Scientist, December 2016.
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不同于流式细胞术（Flowcytometry）、微流控技术（Microfluidics）等其他细胞分选方法，依赖于拉曼光谱学（Raman spectroscopy）的技术不需要对细胞进行标记，且在许多应用中较流式细胞术敏感性和特异性更高。基于此原理发展出的更好的研究方法，如表面增强拉曼光谱技术（Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS），通过将化学物质吸附在金属的表面，增强分子附近电场，促进散射光谱信号发放，可进一步提升对分子鉴定的敏感性和特异性。使用固定于金或银等金属制成的纳米颗粒上的抗体，可在一个分析测试中同时处理6-7个SERS，提供比荧光标记更高辨别率的分子鉴定方法。
随着检测设备和分析方法的快速发展，拉曼光谱学技术在生命科学领域越来越受到青睐，来自英国格拉斯哥市斯特拉斯克莱德大学（University of Strathclyde in Glasgow）的化学教授邓肯·格雷厄姆（DuncanGraham）讲道：“探测器的巨大改进和光源的发展，使得在保持系统性能的同时降低了成本，促进拉曼光谱学仪器在近五年取得了非常快速的发展。反应更快的相机使得对光谱的捕捉时间缩小到微秒级别，更强的软件和统计工具使得对细胞分选和分析后产生的大数据集的分析成为可能。”
以下列举四例利用拉曼光谱学对细胞进行的研究。
1、 改善干细胞疗法
利用人类多能干细胞（Human pluripotent stem cells, hPSCs）是基于干细胞对多种疾病治疗充满希望的途径。但是由hPSCs制备出的细胞经常包含残余未分化细胞，这些细胞的存在使得hPSCs在移植进动物体内后容易引起肿瘤发生。如果残余未分化细胞占总制备细胞的0.1%或更高，流式细胞术或其他检测方法才能够检测出这些细胞，但在使用小鼠进行的一项由未分化细胞引起肿瘤的研究中显示，即使是占比0.001%的未分化细胞也可能会导致畸胎瘤的产生（Cell Cycle, doi:10.4161/cc.8.16.9353, 2009）。hPSCs移植后能否引起肿瘤发生是评价该细胞纯度和安全性的金标准，但此过程通常需要三个月，费用昂贵且存在不确定性，因此给临床干细胞治疗带来很大困扰。
美国艾莫利大学（Emory University）的学者采用SERS技术对hPSCs中的残余未分化干细胞进行了探测和筛除。他们将纳米金颗粒表面包被两种干细胞表面蛋白标志物SSEA-5和TRA-1-60的抗体，再覆以聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）以降低非特异性。他们在混有已知比例成纤维细胞的hPSCs中测试了该纳米颗粒，以确定SERS信号的精确性。实验结果发现，该技术可在一百万个成纤维细胞的背景中识别出仅存的一个干细胞，比流式细胞术的敏感性高2000-15000倍。该技术在hPSC来源的心肌细胞的培养中也同样有效，高度的敏感性和特异性是该分析方法较其他方法的核心优势。针对不同细胞类型应优化条件找到每颗纳米颗粒最适密度的配基，本例中为每颗纳米颗粒25个SSEA-5抗体分子（Biomaterials, doi:10.1016/j.biomaterials.2016.07.033, 2016）。
图1. 表面连接干细胞标志物抗体的纳米金颗粒与细胞结合增强拉曼光谱信号（SERS）
2、 提高细胞分类特异性
多数利用拉曼光谱的研究依赖对细胞的单次拉曼光谱的阅读，但是由于真核细胞的直径通常大于所使用的激光束的直径，导致此方法缺乏准确性。使用单次拉曼光谱阅读时，细胞是否正处于DNA复制期、是否正发生凋亡和坏死以及细胞内的脂滴和蛋白质的数量都会影响测试结果，激光束照射在细胞核和胞质两个部位时也会导致较大差异。理想状态下应该对单细胞进行多次拉曼光谱阅读测试，但这通常会使时间和经济成本大大增加，研究的效率就会相应降低。
来自德国莱布尼茨光子技术研究所（Leibniz Institute of Photonic Technology, Germany）的研究人员发现，使激光束在单个细胞内沿任意线或其他定义好的形状扫描可产生连续的拉曼光谱信号。许多商业光谱仪通常被设计用来分析材料而不是细胞，针对此情况，该团队研究人员利用几种不同的光学镜头、一个多模光纤、机械表和其他组件设计出一种拉曼显微镜，该显微镜可进行单细胞的单点或多点拉曼光谱测试（Biomed Spectrosc Imaging, doi:10.3233/BSI-160141, 2016），且成本较传统商业拉曼光谱仪大大降低。
他们利用此拉曼显微镜对两种胰腺癌细胞系和一种T细胞系进行了分析，并将结果与传统单次拉曼光谱读取的实验方法结果进行了比较，发现利用此方法进行的分析组内差异更小，因此采用该方法通过分析较少的样本即可构建出可靠的细胞分类模型。通过此方法，采用只包含20个细胞分析数据的模型即可对细胞分类达到90%的准确率。该方法有望发展为利用拉曼光谱学对循环肿瘤细胞进行高效率、高通量检测的手段（Analyst, doi:10.1039/C6AN01018K, 2016）。
图2. 使用拉曼显微镜对细胞进行全细胞的分析显示大分子在胞内不均匀分布
3、 追踪癌细胞死亡
利用肿瘤细胞标志物使纳米颗粒靶向结合肿瘤细胞，再给予激光照射加热纳米颗粒可实现特异性地杀伤肿瘤细胞，但其分子机制尚不明确。先前的研究利用流式细胞术和共聚焦显微镜技术检测到了线粒体膜电位的变化，但这些结果都无法确定纳米颗粒是否进入到了癌细胞内，也无法区分癌细胞是通过凋亡还是坏死而被杀死。实验结果的差异被归因于所用纳米颗粒的大小和形状的差异或使用激光照射的强度和时间的差异。
来自美国佐治亚理工学院（Georgia Institute of Technology）的研究者利用具靶向活力的纳米金颗粒去触发热引起的细胞死亡，结合SERS技术实时监测细胞死亡过程。通常SERS技术使用的纳米颗粒大小在50 nm左右，但更小直径的颗粒在激光照射时可减少反射，吸收更多的能量，使产生的热量更易达到杀死细胞的标准。因此该团队研究人员使用了约29 nm直径的纳米金颗粒，以PEG包被并与可增进细胞核吸附的多肽相连接，使用0.2 nM浓度的该纳米颗粒处理细胞，使用785 nm波长激光束对样本照射2小时并收集SERS光谱信号。
最初的光谱信号变化反映出激光照射打破了细胞内蛋白质间的二硫键，随后的信号表明更多的蛋白质和脂质结构由于激光照射引起的热效应而受到破坏，最终导致了细胞的死亡。SERS信号表明利用此方法对细胞的杀伤与直接将细胞放入烤炉中被加热杀死的过程相似，与纳米颗粒的大小或激光强度无关，但高于阈值的纳米颗粒浓度和激光强度仍是引起细胞死亡的必要条件（J Am Chem Soc, doi:10.1021/jacs.5b10997, 2016）。
4、利用SERS诊断和量化疟疾的严重程度
现已有技术可实现当场、低成本、快速地诊断疟疾，但这些技术在早期感染时对疟原虫数量的鉴定缺乏敏感性和特异性。基于实验室技术的流式细胞术可对感染患者的红细胞进行分选，敏感性更高，但通常只能用来分析较少的样本量且主要用于实验室研究，来自新加坡南洋理工大学（Nanyang Technological University, Singapore）的研究者们通过使用SERS技术使廉价、高敏感性的疟疾感染量化诊断得以实现。
在疟疾感染过程中，疟原虫（Plasmodium falciparum）以红细胞中的血红蛋白（Hemoglobin）为生，并将其转化为疟原虫色素（Hemozoin），该物质可作为疾病诊断的标志物，且可被拉曼光谱仪检测到。研究者们采用了两种方法，首先他们合成了一种纳米银颗粒并与从裂解的红细胞中收集的疟原虫色素晶体混合，与纳米颗粒结合的疟原虫色素可产生特异的拉曼光谱信号并被检测到，且敏感性达到了0.01%，约为每微升血液500个疟原虫级别，较流式细胞术敏感性高200倍。在第二种方法中，他们在疟原虫体内原位合成纳米颗粒，通过超声处理裂解红细胞，避免使用脂类溶剂Triton-X，从而使疟原虫及包含疟原虫色素的小液泡得以完整保留，最后在这些小液泡中形成的纳米颗粒可吸附更多的疟原虫色素，与传统裂解红细胞释放疟原虫色素的方法相比，利用此方法可将检测灵敏度提高到约每微升血液2.5个疟原虫浓度。
第一种方法使SERS测试的组内差异较小，使SERS读数和疾病的严重程度有较强的相关性，第二种方法由于灵敏度极高，可作为早期诊断的工具。通过工程技术改造样本和纳米颗粒的制作过程，使其在一个微流体设备上完成，可实现更高效便携、低成本的疟疾现场诊断（Sci Rep, doi:10.1038/srep20177, 2016）。
图3. 左图红箭头示疟原虫小液泡原位合成的纳米银颗粒，右图示细胞裂解后加入纳米颗粒
来源：Jyoti Madhusoodanan, Using Raman Spectroscopy to Identify CellTypes, The Scientist, December 2016.
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